G418 Sulfate遺傳霉素(抗生素)
產品簡介:
產品貨號 | 產品名稱 | 規(guī)格 | 報價(元) |
FS0019-1G | G418 Sulfate遺傳霉素(抗生 素) | 1g | 400.00 |
FS0019-5G | G418 Sulfate遺傳霉素(抗生素) | 5g | 1600.00 |
哺乳動物細胞中,當抗性基因neo被整合進真核細胞基因組后 ,使其編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase,APH(3)II)。此酶通過共價修飾G418的氨基或羥基功能,抑制抗生素-核糖體間的相互作用,從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產生抗性。穩(wěn)轉細胞株篩選實驗,需要建立殺滅曲線(劑量反應曲線)確定殺死無抗性細胞的zui低有效濃度。植物細胞中,通過轉染攜帶nptII基因的抗性質粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶,這個酶使得多種抗生素喪失活性,包括G418,卡那霉素和巴龍霉素。
產品屬性:
英文同義名(English synonym) 中文同義名(Chinese synonym) | Antibiotic G418; G418 Sulfate; G418硫酸鹽;遺傳霉素; |
CAS號(CAS No.) | 108321-42-2 |
分子式(Molecular formula) | C20H40N4O10·2 H2SO4 |
分子量(Molecular weight) | 692.7 |
外觀(Appearance) | 白色粉末 |
純度(Purity) | ~98% |
活力(Potency)(anhydrous) 溶解性(Solubility) | >700 μg/mg 溶于水 |
結構式(Structure) |
G418 Sulfate遺傳霉素(抗生素)
運輸與保存方法
常溫運輸。粉末4℃避光保存,避免受潮,否則會降低抗生素活力。
使用方法
1. G418儲存液的配制(50 mg/mL,活性濃度)
1.1活力單位的換算
根據此公式進行換算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而異。可見批次對應的質檢報告,或者瓶子上的標簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實際稱重的粉末與體積比濃度。
比如若所用批次的G418 活力值為:750 µg/mg,要配制50 mg/mL的G418活性濃度,則實際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。
如果配制10 mL的G418儲存液(活性濃度,50 mg/mL),則需要稱取663.3 mg粉末。
1.2除菌和保存
根據上述換算得到的實際粉末稱重量,加入10 mL無菌去離子水內使其*溶解。
先用5 mL無菌去離子水預濕潤0.22 μm針頭式過濾器,除盡水。之后使用此濾器過濾,除菌后分裝成單次使用的小量(如1mL)放到-20℃凍存,1年穩(wěn)定。
【注】:①不要對混濁的溶液進行過濾,因為混濁的溶液意味著未*溶解,過濾過程中會造成藥物損失,降低終液的活性。②不建議使用液體培養(yǎng)基,NaCl,磷酸鹽溶液或者有機溶劑來制備儲存液。
2. 常用篩選濃度
一般來說,剛開始篩選轉化子需要高濃度的G418,并用一個較低濃度的G418用于維持培養(yǎng)。生長條件,細胞類型和其他的環(huán)境因素都可能影響G418的用量,因此*次使用的實驗體系建議通過殺滅曲線(kill curve),即劑量反應性曲線,來確定篩選濃度。
通常情況,哺乳動物細胞篩選范圍200-2000 μg/mL;植物細胞:10-100 μg/mL;酵母細胞:500-1000 μg/mL;
以下是一些細胞類型使用篩選使用的濃度,可做參考:
細胞類型 | 激活濃度 | 應用 | 引用文獻 |
網柄菌屬 | a) 10 μg/mL b) 30 μg/mL | a)培養(yǎng)在培養(yǎng)液中; b)培養(yǎng)在凍干細菌上; | Hirth,et. al., Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 7356-7360 (1982). |
哺乳動物 | a) 400 -1000 μg/mL b) 200 μg/mL | a)用于篩選 b)用于維持生長 | Canaani and Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., v. 79, 5166-5170 (1982). |
植物 | a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/mL | a)用于篩選 b)用于維持生長 | Ursic, et. al., Biochem. Biophys. Res. Comm., v. 101:3, 1031-1037 (1981). |
酵母 | a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/mL | a)用于篩選 b)用于維持生長 | Jimenez and Davies, Nature, v. 287, 869-871 (1980). |
細菌 | 8-16 μg/mL | 用于篩選 | Waitz, et. al., Antimicrob. Agents Chemother., v. 6:5, 579-581 (1974). |
3. 殺滅曲線的建立
【注】:為了篩選得到穩(wěn)定表達目的蛋白的細胞株,需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素zui低濃度,可通過建立殺滅曲線(劑量反應曲線)來實現(xiàn),至少選擇6個濃度。處理分裂期的細胞時G418的活性強,因此在添加G418之前需要讓細胞培養(yǎng)一段時間。
1) *天:未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養(yǎng)板上,37℃,CO2培養(yǎng)過夜;
【注】:對于需要更高密度來檢測活力的細胞,可增加接種量。
2) 根據細胞類型,設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動物細胞為例,可設定0,50,100,200,400,800,1000 μg/mL。
3) 第二天:去除舊的培養(yǎng)基,換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養(yǎng)基。每個濃度做三個平行孔。
4) 接下來每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。
5) 按照固定的周期(如每2天)進行活細胞計數來確定阻止未轉染細胞生長的恰當濃度。選擇在理想的天數(通常是7-10天)內能夠殺死絕大多數細胞的zui低濃度為穩(wěn)定轉染細胞篩選用的工作濃度。
4. 穩(wěn)定轉染細胞的篩選
4.1 轉染48 h后,用含有適當濃度的G418篩選培養(yǎng)基來傳代細胞(直接傳代或者稀釋后傳代)。
【注】:細胞處于活躍分裂狀態(tài)時抗生素的殺傷效果超好。則當細胞過于稠密,其效率會降低。為了得到較好的篩選效果,將細胞稀釋至豐度不超過25%。
4.2 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。
4.3 篩選7天后觀察并評估細胞克?。洌┑男纬汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時間,這取決于宿主細胞類型,轉染,以及篩選效果。
4.4 挑取并轉移5-10個抗性克隆于35 mm細胞培養(yǎng)板,繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。
4.5 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。
注意事項
1) 本品不可高壓滅菌;
2)不要和其他的抗生素/抗真菌劑(如青霉素/鏈霉素)共同使用,因為它們是G418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也會產生交叉活性。
3) 配制G418溶液時,一定要根據G418批次不同的活力值(potency)來進行換算,從而得到需要活性濃度的儲存液以及工作液。
4) G418加入培養(yǎng)體系中未轉染的細胞有可能不會被殺死,原因在于藥物濃度過低,或者細胞密度過高。另外,快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞,更容易被殺死。對照細胞(未轉染)可能抗生素添加5-7天后才能殺死,轉染細胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14天形成。
5) 即使加入殺死劑量的G418,細胞可能會繼續(xù)分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。
6) 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。